黄芩汤（HQT）是一种中药方剂，临床上常用于治疗炎症性肠病。据报道，HQT对大肠杆菌相关的癌症（CAC）具有抗肿瘤作用。然而，HQT影响炎症转化为癌症的机制尚不清楚。本研究旨在动态评估HQT在缓解或延缓CAC方面的疗效，并揭示其潜在机制；使用偶氮甲烷和1.5%葡聚糖硫酸钠建立了CAC小鼠模型；根据病理切片和血清生化指标评估HQT的疗效；随后使用超高效液相色谱-串联质谱进行氨基酸（AA）代谢分析，并通过蛋白质印迹检测磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素的机制靶点（PI3K/AKT/mTOR）通路。数据表明，HQT可以缓解动物模型中CAC的发展。HQT在炎症诱导阶段以及增殖起始和肿瘤发生阶段有效地降低了炎症反应，特别是白细胞介素-6（IL-6）。在增殖起始和肿瘤发生阶段，免疫组织化学染色显示，HQT组增殖标志物Ki67的表达降低，而凋亡增加。因此，HQT显著降低了CAC患者结肠中特定AA的水平，包括谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和异亮氨酸。此外，HQT显著抑制了活化的PI3K/AKT/mTOR通路，这可能有助于抑制细胞增殖和增强凋亡。因此，HQT可减轻和延缓结肠“炎症致癌”方面，其作用机制可能涉及HQT维持AAs代谢稳态和调节PI3K/AKT/mTOR通路，从而维持增殖和凋亡之间的平衡，进而干扰CAC的发生和发展。
译名：黄芩汤通过调节氨基酸稳态和PI3K/AKT/mTOR通路缓解结肠炎相关结直肠癌
AOM/DSS诱导的CAC小鼠在初始阶段表现出严重的结肠炎，并出现一系列症状，如腹泻、冷漠、嗜睡、食欲不振和体重减轻。随后，逐渐出现脓性和血性大便，这表明多发性结肠肿瘤的发展。长期接触HQT后，上述症状明显改善。模型组小鼠的症状没有明显改善。10周后，与正常（NC）组相比，开云网站 真人平台模型小鼠的体重增加较低。尽管体重没有显著变化（图1B），但HQT显著恢复了CAC小鼠结肠长度的升高（p0.05）（图1C）。本研究中AOM/DSS的肿瘤诱导率为100%。HQT处理后肿瘤总数显著降低（p0.05）。HQT显著降低了结肠中腺瘤和微腺瘤的总数（图1D）。此外，与NC组相比，模型组胸腺重量减少（p0.01）。与NC组相比，模型组脾和肺的重量增加（分别为p0.01和p0.05）。经HQT处理后，脾和肺的这两个参数均低于模型小鼠的记录（分别为p0.01和p0.05）；此外，胸腺的重量也增加了（p0.01）（图1E）。
图1 HQT缓解了AOM/DSS诱导的小鼠CAC。（A）本研究中使用的AOM/DSS模型图。（B）AOM/DSS诱导期间小鼠的体重变化。（C）结肠长度（cm）。（D）结肠肿瘤计数及其大小分布，红色箭头表示息肉。每组n=12。（E）胸腺、脾脏、肝脏、肺、心脏和肾脏与体重的比率。与正常对照组相比，#p0.05和##p0.01；与模型组相比，*p0.05，**p0.01。
根据CAC过程的“炎症-增殖-癌”模式，我们观察生化指标，并对上述三个阶段的病理切片进行分析。与NC组相比，白细胞介素-6（IL-6）、IL-1β和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在三个阶段均显著升高。IL-4和IL-10仅在早期炎症阶段显著下调。HQT显著逆转了AOM/DSS诱导的这些细胞因子变化，包括IL-6、IL-1β和TNF-α浓度的降低。与NC组相比，CA199在CAC肿瘤发生阶段显著增加，表明模型小鼠发生了肿瘤（图2A）。此外，流式细胞术显示CAC小鼠的CD4+/CD8+细胞比率较低（图2B），表明免疫缺陷。HQT处理后，CD4+/CD8+免疫指标的较低比率增加。
图2 HQT减轻了AOM/DSS在CAC小鼠中诱导的炎症反应和免疫紊乱。（A）炎症、增殖和肿瘤形成三个阶段中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10相对丰度的折线图。（B）流式细胞术检测CAC小鼠T淋巴细胞表达。与正常对照组相比，#p0.05和##p0.01；与模型组相比，*p0.05，**p0.01。
苏木精和伊红染色显示，与NC组相比，模型组在炎症诱导阶段炎症细胞浸润明显。随着疾病进展到增殖起始和肿瘤发生阶段，肌肉层增厚，黏膜层细胞异常增殖，最终形成晚期上皮内肿瘤高度病变。HQT有效地抑制了炎症反应、异常细胞增殖和肿瘤发生（图3A）。此外，增殖标志物Ki67和Tunel染色显示，在炎症期，模型小鼠的结肠组织有轻微的增殖和明显的凋亡，HQT组显著抑制了凋亡。在增殖起始和肿瘤发生阶段，模型组Ki67组织评分明显高于NC组（p0.01）。我们在Tunel组织评分中也观察到了类似的结果。随着疾病的进展，这些细胞沿结肠隐窝长度过度增殖和异常分布，而模型小鼠的凋亡逐渐减少。HQT有效地扭转了这种局面；HQT组Ki67的组织评分高于模型组（p0.01）（图3B），而凋亡标志物的组织评分显著改善（p0.05）（图3C），表明HQT能够促进结直肠肿瘤组织从增殖向凋亡的转变。
图3 HQT在AOM/DSS模型中抑制结肠肿瘤的进展。（A）结肠组织H&E染色代表性照片，200×。黑色箭头表示炎性细胞浸润。（B）Ki67阳性细胞率和（C）TUNEL法细胞凋亡定量。每组n=5。与正常对照组相比，#p0.05和##p0.01；与模型组相比，*p0.05，**p0.01。
2. HQT在AOM/DSS小鼠中恢复了AAs稳态，特别是在增殖起始和肿瘤发生阶段
肿瘤细胞的异常增殖与AA能量供应密切相关。因此，我们进行了靶向AA代谢组学分析，以评估结肠组织中25种AA的水平（表1）。我们检查了炎症诱导、增殖起始和肿瘤发生三个阶段AA水平的变化（表2）。在炎症诱导阶段，近一半的AA呈明显下降趋势，其余一定比例的AA在模型组中上调，表明了AA代谢重编程的激活。在HQT干预后，只有少数AA，如谷氨酸和异亮氨酸，显著增加。在增殖起始和肿瘤发生阶段，超过三分之二的AA水平升高。同时，HQT有效地降低了几种氨基酸的水平，包括谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、异亮氨酸、5-oxo-脯氨酸、赖氨酸、丝氨酸和蛋氨酸（图4）。总之，这些数据支持了HQT改善了AAs积累，并在CAC疾病发展的整个过程中调节了AAs代谢稳态的观点。
表2 炎症形成、增殖起始和肿瘤发生三个阶段结肠组织中25种氨基酸物质的含量（pg/mg，n=10）
图4 HQT在炎症形成、增殖起始和肿瘤发生三个阶段对特定氨基酸的调节。每组n=10，与正常对照组相比，#p0.05和##p0.01；与模型组相比，*p0.05，**p0.01。
我们试图研究HQT调节细胞凋亡的机制。因此，我们进行了蛋白质印迹来研究其对PI3K/AKT通路的影响，PI3K/AK通路是一种调节增殖和凋亡的信号通路。考虑到HQT在炎症诱导阶段抑制细胞凋亡，并在增殖起始和肿瘤发生阶段转变为促进细胞凋亡，蛋白质印迹检测了这三个阶段PI3K/AKT/mTOR通路中主要蛋白质的表达。在炎症诱导阶段，PI3K/AKT/mTOR通路显示出抑制趋势，模型组促增殖激活剂mTOR及其效应蛋白CDK2的水平显著降低。HQT增加了CDKs蛋白的表达（图5A）。在增殖起始和肿瘤发生阶段，PI3K/AKT/mTOR通路都被激活。在模型小鼠中，磷酸化-PI3K（p-PI3K）、p-AKT和mTOR的表达显著上调。与模型组相比，HQT组的p-PI3K（p0.05）和p-AKT（p0.05）降低。此外，促增殖激活剂mTOR及其效应蛋白CCND1、CDK2和CDK4的水平在HQT组中也显著降低（p0.05）（图5B，C）。综上所述，这些结果表明，HQT的抗癌作用是通过抑制PI3K/AKT途径限制结直肠肿瘤细胞的增殖并促进其凋亡来诱导的。
在本研究中，HQT通过调节增殖和凋亡之间的平衡，显著抑制了DSS诱导的小鼠结直肠肿瘤发生。HQT显著降低了结直肠肿瘤计数，改善了显微组织病理学，逆转了结肠长度缩短和结直肠肿瘤。就器官重量而言，HQT给药减少了AOM/DSS诱导的脾脏增大。在AOM/DSS研究中，脾脏肿大通常是由炎症升高引发的CRC分级的标志。在一项使用茶多糖减少AOM/DSS诱导的脾脏增大的研究中也了类似的发现。作为免疫系统中枢调节器官的胸腺指数在AOM/DSS组中有所下降。与萎缩胸腺中的观察结果一致，AOM/DSS小鼠血清中的CD4+/CD8+T细胞比率也降低了，证实了CAC免疫功能紊乱。
CAC的发病机制涉及多个阶段，包括正常黏膜上皮损伤、异常隐窝病灶、腺瘤和腺癌，该模式从炎症进展到非典型增生和癌变。在炎症相关癌变过程中，炎症因子（如IL-6、IL-1β和TNF-α）的水平在所有三个阶段都升高了；IL-6的升高最为显著。细胞因子，如IL-6、TNF-α和IL-1β，可以促进CRC上皮细胞的生长和增殖；IL-6和TNF-α可以激活信号转导子和转录激活子3（STAT3）和核因子-κB（NF-κB），导致持续的炎症。IL-6被认为是炎症和肿瘤发展之间缺失的环节。这些促炎因子在所有三个阶段给药后均显示出良好的抑制作用。与之前的结果一致，HQT有效地干扰了结肠炎向癌症的进展。结合炎症因子的结果，我们得出结论，HQT的早期炎症干预在“炎症转化为癌症”的过程中起着至关重要的作用。
上皮细胞凋亡和增殖之间平衡的破坏可能与结肠炎和结肠癌的发生有关。Ki67和Tunel染色结果显示，模型小鼠的增殖和凋亡指数均显著增加。增殖指数在随后的DSS周期中逐渐增加，并与CAC的严重程度平行。凋亡指数在炎症诱导阶段急剧增加，但在异常增殖开始后显著降低。事实上，在UC中，细胞凋亡增加。上皮细胞凋亡是一种非特异性现象，超过组织细胞吞噬能力的凋亡细胞数量的增加可能在破坏上皮防御和进一步加速黏膜炎症中发挥作用。HQT可以抑制结肠上皮细胞凋亡，这部分解释了HQT可以改善炎症损伤。Replicating细胞沿结肠隐窝长度的过度增殖和异常分布被认为是增加对结直肠癌易感性的生物标志物。异常和持续的上皮过度增殖可能与大肠癌的高发病率有关，这种高发病率发生在结肠炎和UC的实验模型中。在增殖期和肿瘤期，HQT诱导细胞增殖至凋亡，这可能是延缓癌症形成的关键。
在营养缺乏的情况下，肿瘤细胞的代谢重编程赋予了它们快速增殖的能力。AA代谢重编程是肿瘤异常代谢变化的重要特征。我们的研究结果表明，AAs的表达随着炎症转化为癌症的进展而变化。与增殖起始和肿瘤发生阶段的测量值相比，炎症诱导阶段的AA水平降低。根据文献，研究者在DSS处理的大鼠和IBD患者中都观察到多种AA水平的降低。AA摄入不足会损害淋巴组织诱导细胞的活化，加重DSS诱导的小鼠结肠炎。在增殖起始和肿瘤发生阶段，大多数AA的水平显著升高。这一发现表明，在增殖起始阶段，异常肿瘤增殖对能量的高需求导致AA需求急剧增加。HQT在炎症诱导阶段对AAs的表达没有明显的调节作用，在增殖起始和肿瘤发生阶段显著调节了几种AAs。重要的是，HQT对谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、异亮氨酸和丝氨酸具有调节作用。研究者已经证明，增殖细胞对谷氨酰胺有很强的需求，谷氨酰胺是肿瘤细胞首选的氨基酸之一。谷氨酰胺是仅次于葡萄糖的肿瘤细胞的能量来源。注射谷氨酸可以显著增加细胞增殖和抗氧化水平，同时降低结肠黏膜细胞凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（CASP3）水平。文献证明IL-6可以增加患有全身炎症的CRC患者对谷氨酰胺的需求，并将AAs驱动到组织中，这部分解释了炎症因子与AAs在癌症发病中的关联。此外，饮食中的精氨酸通过涉及一氧化氮合酶2（NOS2）的机制，增加了小鼠模型中腺瘤肉病结肠依赖性结肠癌发生的风险。精氨酸增加了这些小鼠的结肠肿瘤数量和肿瘤等级，这可以通过大小和形态参数来评估。因此，HQT在增殖起始阶段对增殖细胞的抑制作用可能与AA水平的降低直接相关。
几项研究揭示了特定氨基酸调节mTOR激活的机制，特别是谷氨酰胺、异亮氨酸和精氨酸，它们是mTORC1激活中最重要的氨基酸。此外，对特定氨基酸（包括蛋氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）的饮食限制会特异性抑制mTORC1。在本研究中，我们发现致癌PI3K/AKT/mTOR/CCND1通路的调节有助于整体抗CAC作用。失调的PI3K/AKT/mTOR通路的过度激活有助于CRC细胞的增殖和癌变。PI3K/AKT通路故障分别在90%和80%的人类CRC病例和AOM/DSS模型中观察到，表明该通路是一个重要的治疗靶点。CRC中PIK3CA和AKT基因的突变诱导过表达促进PI3K/AKT通路的激活，并增强癌症细胞的增殖和存活，同时抵抗凋亡。Akt可以结合并磷酸化前列腺凋亡反应蛋白-4（Par-4），从而灭活Par-4的促凋亡作用。抑制PI3K-Akt通路导致Par-4依赖性凋亡。下游转录因子CCND1受AKT和mTOR的正向调节；CCND1的降解加速了CRC细胞G1期的细胞周期阻滞。免疫印迹分析显示，在CAC的炎症诱导阶段，mTOR及其效应蛋白CDK2下调，Tunnel染色显示该阶段的细胞凋亡急剧增加；这可能与特定AA的下调有关，后者抑制了mTOR和CDKs的活性。HQT对细胞凋亡的抑制可能与CDK2功能失调的恢复密切相关。随后，在增殖和肿瘤发生阶段，p-PI3K、p-AKT、CCND1和CDKs的上调表明，AOM/DSS小鼠的PI3K/AKT/mTOR通路被激活。在HQT的影响下，随着AA的减少，HQT有效地抑制了PI3K/AKT的激活。我们的研究结果已经证明PI3K/AKT/mTOR信号通路参与调节各种癌症细胞和组织的增殖。与Ki67和Tunel染色的结果一致，HQT在免疫组织化学分析中降低了增殖标志物Ki67的水平，并促进了CAC的凋亡。因此，HQT对AAs水平和PI3K/AKT/mTOR的调节可能是炎症阶段较低凋亡率向增殖和肿瘤发生阶段较高凋亡率转变的诱导机制。这些数据还表明，抑制PI3K/AKT/mTOR通路在HQT调节结直肠肿瘤发生中具有重要意义。
在动物研究中，HQT可以增强不同类别抗癌药物的抗肿瘤活性，并促进伊立替康或放射治疗后受损肠道的更快恢复。HQT联合疗法可能是目前某些癌症治疗方案的替代方案。耶鲁大学的Yung-Chi Cheng教授领导的团队已经研究了YIV-906，这是一种基于HQT的抗癌药物，目前正在美国进行临床试验，通过化疗和放疗相结合来治疗结直肠癌、肝癌和胰腺癌。总之，我们的研究支持HQT在减轻结肠“炎症致癌”方面的治疗潜力，它不仅在炎症诱导阶段减少了炎症反应和进一步的细胞凋亡损伤，而且在增殖起始和肿瘤发生阶段降低了AAs和下游激活的PI3K/AKT/mTOR通路的表达，从而抑制异常上皮细胞增殖并促进其凋亡。事实上，本研究可能首次证明HQT维持了AAs代谢稳态，调节了PI3K/AKT/mTOR通路，从而维持增殖和凋亡之间的平衡，进而干扰CAC的发生和发展。
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